基因测序技术是什么? 它应用在什么方面?
DNA测序技术,即测定DNA序列的技术。在分子生物学研究中,DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。目前用于测序的技术主要有Sanger等(1977)发明的双脱氧链末端终止法和 Maxam和 Gilbert(1977)发明的化学降解法。这二种方法在原理上差异很大,但都是根据核苷酸在某一固定的点开始,随机在某一个特定的碱基处终止,产生 A,T,C,G四组不同长度的一系列核苷酸,然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测,从而获得DNA序列。目前 Sanger测序法得到了广泛的应用。
一、DNA测序技术,又叫基因测序技术。
人类基因组这部由A、T、G、C四个字母组成的卷帙浩繁的生命天书如同一座宝库,保藏着几千年来人们迫切想知道的秘密,DNA测序技术就好似“芝麻开门”这样的咒语,是我们打开宝库的金钥匙世界上第一个测定DNA序列的方法是由英国生化学家弗雷德里克·桑格尔发明的。自此DNA测序的速度就一直呈加速态势。2001年人类基因组草图耗资4.37亿美元,耗时13年。到了2007年,第一个完整人类基因组序列图谱的诞生只花费了150万美元,3个月就搞定。2009年1月2日,美国加州太平洋生物科学公司的科学家乔纳斯·考尔拉赫、斯蒂芬·特纳及其研究小组在《科学》杂志上发表论文称,他们将纳米技术与芯片技术相结合,发明了一种新型测序方法,速度是现有技术的3万倍。
二、DNA sequencing technology
Sanger 法测序的原理就是利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成,每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP),并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团,使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整,使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点,但终止在不同的的核苷酸上,可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段,凝胶处理后可用X- 光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。
三、非同位素银染测序系统操作技术
Promega公司的SILVER SEQUENCETM DNA测序系统是一种无放射性的序列分析系统,它通过灵敏的银染方法检测凝胶中的条带。银染提供了一种对于放射性或荧光法来说更加快速,廉价的替代方法。测序结果可以在同一天内得到;电泳完成后经90分钟就可读序,这是常规的放射性测序法做不到的。 此外, SILVER SEQUENCETM系统用未修饰的5\'OH寡聚核苷酸作为引物,减少了特殊修饰寡聚核苷酸的花费。该系统不需要放射性方法中对同位素的谨慎操作,也不需要荧光法或化学发光技术的昂贵试剂。另外,也不需要象大多数荧光法那样用仪器来检测序列条带。
四、设备
DNA测序仪,性能特点,自动化程度高,提供连续、无需监控的操作,自动灌胶、上样、电泳分离、检测及数据分析,可连续运行24小时无需人工干预。样品分析量大,一束毛细管可同时对16个样品进行全自动分析,一天可完成数百个样品的测序或片段分析工作。先进的荧光检测系统,采用光栅分光,CCD摄像机成像技术,实现多色荧光同时检测,与传统的滤镜及光电倍增管的检测方式相比,光栅及CCD的优势在于更新荧光化学时无需更换任何硬件设备。从激光光源发出的光线被光学元件分成两股,16根毛细管被一束激光同时从两面照射,有效提高荧光检测灵敏度和均一性。DNA测序仪在2011年前多由美国生产。
2011年4月18日,由中科院北京基因组研究所与中科院半导体研究所承担的“模块化DNA分析系统”项目通过评审验收。这标志着我国在第二代DNA测序仪研发方面,形成了具有自主知识产权的高通量DNA测序技术及其系统样机。日前,验收组对该项目进行了测试和验收考核。验收组认为,此项目完成了仪器研制项目实施方案所要求的各项技术指标,有效测序片段数量、平均读长和有效序列数据总产量等关键技术性能指标远远优于立项指标,该成果实现了与国际主流设备性能相当的国产化DNA测序能力,在基因组学、生物信息学,乃至生命科学诸多方向的基础研究和应用研究方面具有重要实用价值。项目负责人、中科院北京基因组所副所长于军表示,计划下一步将继续开发适应于我国科研需求的下一代测序仪、配套试剂、芯片和测序分析软件等,使这一设备全面实现系统功能。
高压电泳仪,测序用电泳槽,制胶设备,PCR仪。