韩春雨论文翻译 韩春雨NgAgo论文中文翻译
为了将此系统与Cas9系统做对比,我们同时转染了pEGFP-N1和一个Cas9表达载体和sgRNa表达载体靶向于pEGFP-N1。通过对eGFP表达量的研究,我们认为NgAgo的效率与Cas9系统相差不大。同时利用这种方法我们得到了gDNA的最佳长度为24bp(见图3d)
靶位点存在的广泛性与低的错配效应
之后,我们探究了NgAgo系统在人基因组的内源性位点进行基因编辑的可能性。我们设计了一个改进的NgAgo蛋白,在其N端设计了一个核定位信号。我们设计了5gDNA对应于人类DYRK1A基因的第11个外显子。通过T7E1酶酶切去寻找内源性的基因突变。我们发现所有的gDNA都能高效诱导靶位点的切割的发生,同时我们通过测序证明了这一点。(见图4a)
同时,我们针对8个基因设计了47个靶位点gDNA,所有gDNA的基因编辑的效率是相差不多的 (21.3?41.3%;)(见图4b)。
并且我们并没有发现NgAgo对于序列本身的性质有明显的偏好。我们同时在多种哺乳细胞中验证NgAgo-gDNA系统,NgAgo均可以在这些细胞的DYRK1A基因区诱发DSBs(见图4c)。
为了研究NgAgo系统中,gDNA可能与靶位点存在的碱基错配的现象,我们在24nt的gDNA(靶向于DYRK1A基因)中的每个位置都引入一个单碱基突变。Ngago对于单碱基突变的gDNA特别敏感(切割效率降低73%~100%),并且等单碱基突变出现在8~11个碱基处时,切割效率降低85~100%。在gDNA中任何3个连续碱基的错配都将使NgAgo的酶切活性完全丧失(见图4d)。
为了探究NgAgo对于单碱基的敏感度是不是会随着gDNA的长度的变化而改变,我们用同样的方法去研究了21nt的gDNA,单碱基突变在21nt gDNA的任何位置都会改变NgAgo的活性。并且第8到11个碱基同样的是最为敏感的区域,更为根本的影响NgAgo的活性。
考虑到CRISPR/Cas9最多可以允许5个碱基的错配。这些数据,虽然只能初步的证明NgAgo所具有的低脱靶活性和高保真性。并且gDNA上第八个碱基的磷酸二酯键可能是NgAgo发挥核酸内切酶活性的重要部分,因为在第八个碱基上单碱基的突变就可以完全使NgAgo丧失核酸内切酶活性。
我们利用哺乳动物中的DYRK1A基因来比较CRISPR/Cas9系统与NgAgo系统的切割效率,因为该基因已经在Cas9的研究中广泛应用。NgAgo系统和Cas9系统在该位点的切割效率相差不大。(Fig. 4e, 31.97% for NgAgo vs. 32.2% for Cas9)(见图4e)
然后,我们测试了NgAgo系统是否在GC富集区进行切割要比Cas9系统更有优势。因为gRNA在这些区域更容易产生高级结构,而DNA则不会,这就会影响gRNA与Cas9复合物的形成。结果表明在GC富集区,NgAgo的切割效果明显好于Cas9系统。
这就证明了NgAgo在基因编辑区域的选择上面较Cas9系统更有优势。此外,根据相关的研究和我们的实验,Cas9系统发挥作用需要在靶位点的下游存在PAM序列,而NgAgo并无此要求。
NgAgo在基因敲入中的应用
当我们验证了Ngago
能够在哺乳动物基因组中的靶位点上发生切割,我们下一步开始探究
