[危机升级]:国际协会主席和多国科学家质疑韩春雨诺贝尔成果
对于方舟子和网友们提出的质疑,韩春雨在该回复里进行了详解解答:细胞做好检测,不要有寄生菌污染,不要有支原体污染(Ago系统对污染特别敏感---特别是单转guide假阳性---我非常确定在没有污染的情况下,单转guid不会影响GFP表达,假阴性也大多因为细胞污染,假阳性和假阴性我都遇到过,国内买的细胞我就不吐槽了),转染用的质粒质量要好(可用30ngGFP转细胞,若是均一且效率高表明质量好,强弱不均一则表明质量差,越不均一表明质量越差),guide磷酸化完全(没有磷酸化不能load和切割---谢谢印证我的Fig2结果,至于怎么检测,自己跑个PAGE看看---)
韩春雨的回复:也是几乎惟一算是有难度的,就是控制转染时的细胞密度和用血清控制细胞生长,时间稍长,毕竟NgAgo未经过系统的密码子优化---照着online method上protocol for genome editing and T7E1做(小经验,PCR最好不要有引物二聚体,如果引物二聚体多请重设引物;PCR产物直接回收最好不跑胶回收,可能跟ago切24bp有关,设好对照!
欢迎大家广泛使用此系统,并分享成功经验和失败教训。附,addgen上的质粒,可以直接用作基因组编辑。再次强调,不加NgAgo,就能抑制GFP,是假阳性,是细胞出问题了(谢天谢地不但我自己而且审稿人也有这个对照)出现假阳性的细胞切基因组就没戏了。
对于Fig4,若是不习惯做银染,也可以直接做KI:doner 用GFPcoden polyA signal,前后加几个保护性的碱基---从GFP-N1扩出来连到T-vector上,再从此doner-Tvector上扩(防止GFP-N1污染的假阳性)出来纯化,500-800ng共转(for each well of 24 well plate)。
而对于韩春雨的回复,方舟子也做出了回应:那么这种"高超的实验技术"究竟是不是实验细节的处理,不同网友也有自己的看法,有网友表示pcr已经有那么久的历史,且机器已经半自动化,但目前也不是每个人次次都能成功。
在实验过程中,技术不难,难的是整个实验过程都不能有半点差错。韩春雨老师经过几年发表出来的结果,而目前大部分实验室也只刚刚尝试几个月。关键一步都没处理好,所以做不出来,但是恰恰是关键的一步 这也是他能做出来成果,别人做不出的原因。
韩春雨老师也强调了无污染的细胞重要性:而对于目前大家较为关注的重复性问题,目前网上虽然有一些表示没有重复出来,一方面韩春雨老师经过几年发表出来的结果,而目前大部分实验室也只刚刚尝试几个月,另一方面一些网友认为目前重复不出来的原因也可能是在这个风口浪尖,为避免惹祸上身,重复出来的人也未必想站出来发声。
而且也有网友爆料来自印度的学者Dr. Debojyoti Chakraborty发言已重复出韩春雨NgAgo实验。
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