稳定同位素标记技术
细胞培养稳定同位素标记技术细胞培养稳定同位素标记技术(1)(stable isotope labeling by amino acids, SILAC)最初由Mann等人于2002年提出,在氨基酸缺陷型的培养基中加入标记的必需氨基酸,这些氨基酸将通过蛋白质合成,而整合进入蛋白质中,这一方法没有化学修饰或者亲合分离等步骤。Mann的文章最初将此方法用于哺乳类细胞培养中,现在SILAC技术已经广泛用于酵母(2)、大肠杆菌(3)、和拟南芥(4)。
SILAC所使用的策略在于,有一些氨基酸是细胞自身所不能合成的,只能通过外界摄取,称之为必需氨基酸,培养基必须提供这些氨基酸,细胞才能生长。将特定的必需氨基酸进行同位素标记,并且代替其相应的非标记氨基酸在培养基中提供,细胞将利用这些标记有同位素的氨基酸去合成新的蛋白质。进行一定次数的传代之后,这种特定的氨基酸将被同位素标记的氨基酸所取代。同位素标记的氨基酸与正常的氨基酸,其化学属性是一样的,因此细胞在含有同位素标记氨基酸的培养基中生成无异于正常养基。
两个不同的样本,分别是用非标记(轻链)和标记(重链)的氨基酸培养基培养,裂解细胞提取蛋白后,以1:1混合,进行酶解,就可以进行质谱分析。与ICAT等标记不同的是,SILAC是在代谢的过程中进行标记,而非对提取的蛋白进行化学修饰。SILAC的实验流程如图1所示,同位素标记有多种氨基酸可供选择,一般使用精氨酸、亮氨酸、赖氨酸以及蛋氨酸。对于SILAC氨基酸的选择一个重要的标准是与正常氨基酸必须有至少4Da的质量差(5), 例如肽段中每一个L-arginine-13C6提供6Da的质量差。
同位素亲合标签技术同位素亲合标签(6)(isotope-coded affinity tags, ICATs)最初由Gygi等人于1999年提出,在半胱氨酸残基特定位点上标记同位素亲合标签。试剂如图2所示,由三部分组成,第一是生物素(Biotin),能够结合抗生物素蛋白柱子;第二是一个连接子(linker),含有稳定同位素;第三部分是连接在半胱氨酸残基上的反应基团碘乙酰胺(iodoacetamide)。有两种标签,一种是连接子里没有氘,这是轻链;另一种连接子里有8个氘,这是重链。进行蛋白质定量的实验原理如图3表示,检测组和对照组,或者是两种不同状态的样品,分别用轻链和重链的ICATs进行标记,两个组分进行合并,酶解,再以抗生物素蛋白柱子进行亲合分离,含有标记半胱氨酸残基的肽段通过RP-HLPLC洗脱分离进入质谱仪,同一肽段有两种形式,分别标记轻链和重链的ICATs,质量差为8 Da,这两者的比值确定了这一肽段的相对定量值,并通过数据分析,由此而得出相应蛋白质的相对丰度。
